摘要：為了檢測重組蛋白SPAG11D的抑菌活性，提取牛睪丸組織總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增了SPAG11D基因，將該基因插入pET-32a(+)融合表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入BL21(D3)進(jìn)行原核表達(dá)，通過改變IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化表達(dá)條件，并用瓊脂擴(kuò)散法測定重組蛋白體外抑菌活性。結(jié)果顯示，成功擴(kuò)增牛SPAG11D基因，產(chǎn)物大小為390 bp，其序列與GenBank公布序列相一致;正確構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32a(+)-SPAG11D，重組蛋白最佳表達(dá)條件為IPTG終濃度1.0 mmol /L、誘導(dǎo)時(shí)間為4 h;表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量約為33 kDa;該重組蛋白對(duì)霍亂弧菌具有明顯的體外抑菌活性。本研究成功構(gòu)建了牛SPAG11D基因的原核表達(dá)載體，并獲得了具有抑菌活性的重組蛋白His-SPAG11D。

　　關(guān)鍵詞：論文網(wǎng),牛,原核表達(dá),SPAG11D基因,抑菌作用

　　Abstract：In order to detect the antibacterial activity of recombinant proteinSPAG11D， the total RNA was extracted from the testis of bovine. The SPAGLLD gene was amplified by RT-PCR. After sequencing DNA， the gene was cloned into fusion expression vector pET-32a(+). The fusion protein of His-SPAG11D was produced under IPTG induction. The expression condition was optimized under inducement with different dosages of IPTG and inducement time. The in vitro antibacterial activity of the recombinant protein was detected by agar diffusion method. The results showed that the SPAGLLD DNA fragment with the length of 390 bp was successfully amplified. The sequence was consistent with the sequence on GenBank. The recombinant plasmid pET-32a(+)-SPAG11D was constructed successfully. The optimal expression condition was the IPTG final concentration of 1.0 mmol/L， with the induction time of 4 h. The molecular mass of expressed recombinant protein was about 33 kDa. The recombinant protein was significant in vitro antibacterial activity to Vibrio cholerae. It is indicated that the prokaryotic expression vector of SPAG11D gene from the testis of bovine was successfully constructed. The obtained recombinant protein His-SPAG11D had antibacterial ability.

　　Key words： bovine; prokaryotic expression; SPAGLLD gene; antibacterial activity

　　精子相關(guān)抗原11(Sperm associated antigen 11，SPAG11)是精子膜上的一種蛋白，也是β防御素的一種，由2個(gè)相互獨(dú)立的β防御素基因通過通讀轉(zhuǎn)錄連接到一起[1]，主要在哺乳動(dòng)物的睪丸、附睪和雄性生殖道中表達(dá)。SPAG11被認(rèn)為在雄性生殖道的先天免疫、精子的成熟以及透明帶的識(shí)別和精卵結(jié)合等事件中起到重要的作用[2-4]。

　　雄性生殖系統(tǒng)的病原感染嚴(yán)重威脅其生殖和內(nèi)分泌功能，如沙眼衣原體可以引起附睪炎并阻礙附睪內(nèi)精子的運(yùn)動(dòng)[5]。而SPAG 11蛋白能夠抵御病原微生物對(duì)機(jī)體生殖道的侵害。對(duì)人的SPAG11各蛋白亞型研究表明，其N-端都具有抗菌活性，而且人的SPAG11C蛋白抗大腸桿菌活性遠(yuǎn)大于該亞型N-端的抗菌活性[6，7]。此外還發(fā)現(xiàn)，獼猴的SPAG11蛋白也具有抗菌活性。

　　目前認(rèn)為SPAG 11在精子通過附睪的過程中參與精子的成熟。Zhou等[4]發(fā)現(xiàn)大鼠附睪頭部的SPAG11E蛋白結(jié)合在精子的頭部，在附睪尾部的蛋白結(jié)合在精子頂體后部，這表明SPAG11E蛋白在精子通過附睪時(shí)對(duì)精子起一定的修飾作用，此外SPAG11E蛋白能夠提高未成熟精子的運(yùn)動(dòng)能力。

　　在牛體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)6種SPAG11蛋白亞型：SPAG11C、SPAG11D、SPAG11E、SPAG11U、SPAG11V、SPAG11W[8]，它們存在于睪丸、附睪、輸精管上皮以及非生殖道組織中。余樹民等[9]在牦牛生殖器官中也檢測到了這6個(gè)亞型的表達(dá)。 　　1 材料與方法

　　1.1 試劑

　　Trizol試劑購自Invitrogen公司;cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、Hind III和 BamH I限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司;T4 DNA連接酶購于Biolabs公司;EasyPure Plasmid MiniPrep Kit質(zhì)粒快速提取試劑盒、EasyPure Quick Gel Extraction Kit瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;TEMED購自Amresco公司;異丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自Merck公司;氨芐青霉素(Amp)購自Sigma公司;丙烯酰胺、過硫酸銨、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭��?/p>

　　1.2 菌種和質(zhì)粒

　　E. coli DH5α、BL21(DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;pET-32a(+)、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌O139、大腸桿菌O157、大腸桿菌K88、大腸桿菌K199和沙門氏菌為本實(shí)驗(yàn)室保存。

　　1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

　　剛出生的小公牛。

　　1.4 引物設(shè)計(jì)

　　根據(jù)GenBank上公布的牛抗精子抗體SPAG11D(KC899318.1)基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異引物：P1： 5′-CGGGATCCATGAAGCAATTCCTCGC -3′，P2：5′-CCCAAGCTTCTAGGTGCCTGATCTG-3′

　　1.5 SPAG11D基因的克隆和測序

　　取小公牛睪丸和附睪組織，于液氮中保存。RNA提取參照文獻(xiàn)[10]的方法提取組織的總RNA，以O(shè)lig(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄生成第1鏈cDNA。以P1、P2為引物擴(kuò)增SPAG11D基因。反應(yīng)體系(20 μL)如下：ddH2O 7.4 μL，模板2 μL，P1和P2 (10 pmol/L)各0.3 μL，TaqDNA聚合酶10 μL。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。

　　用DNA凝膠回收試劑盒回收SPAG11D基因的PCR產(chǎn)物，連接于克隆載體PUC57，構(gòu)建 PUC57-SPAG11D質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定后送上海生工生物工程有限公司測序。

　　1.6 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

　　用Hind III和BamH I 雙酶切PUC57-SPAG11D，再克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)的Hind III和BamH I位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-SPAG11D，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)雙酶切鑒定篩選得到陽性克隆。

　　1.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化

　　將鑒定好的重組質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒pET-32a(+)分別轉(zhuǎn)化到E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單菌落，接種到3 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。取活化后的菌液0.l mL加入到10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、 200 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h，當(dāng)菌液OD600 nm為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度1.5 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別取1 mL誘導(dǎo)0、3、4和5 h的菌液，12 000 r/min離心2 min，收集菌體，加入40 μL滅菌ddH2O，再加入等體積2×SDS加樣緩沖液，混勻，煮沸5～10 min，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的表達(dá)情況。

　　分別用不同的IPTG劑量(終濃度為1.0、1.5、2.0 mmol/L) 和誘導(dǎo)時(shí)間(3、4、5 h)進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化。優(yōu)化表達(dá)條件后，進(jìn)行15% SDS-PAGE分離，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、數(shù)次脫色后拍照觀察結(jié)果。

　　1.8 抑菌活性測定

　　收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌，壓力破碎后離心收集上清液。利用瓊脂擴(kuò)散法檢測重組蛋白的體外抑菌活性：金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌O139、大腸桿菌O157、大腸桿菌K88、大腸桿菌K199和沙門氏菌于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)12 h。調(diào)整菌液濃度為108 CFU/mL;再將菌液稀釋適當(dāng)倍數(shù)。將稀釋后的菌液均勻涂布于平板上。待瓊脂表面水分干燥后，用鑷子將無菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中，吸取上清液0.16 mL至牛津杯中。平皿放置4 ℃冰箱擴(kuò)散8 h，轉(zhuǎn)入37 ℃溫箱中10～12 h后觀察并測定抑菌圈的大小。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 SPAG11D基因的PCR擴(kuò)增

　　SPAG11D基因的PCR的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示大小約 390 bp左右的片段，與預(yù)計(jì)的片段大小相符(圖1)。

　　2.2 克隆載體的構(gòu)建及鑒定

　　將SPAG11D基因的PCR產(chǎn)物連接于克隆載體PUC57，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)雙酶切鑒定后測序。雙酶切結(jié)果如圖2所示，測序結(jié)果與GenBank上發(fā)表的序列相一致。

　　2.3 表達(dá)載體的雙酶切鑒定

　　經(jīng)測序鑒定正確的克隆載體經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切，克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)上，構(gòu)建表達(dá)載體pET-32a(+)-SPAG11D，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)雙酶切鑒定篩選得到陽性克隆(圖3)。

　　2.4 原核表達(dá)產(chǎn)物的檢測及條件優(yōu)化

　　將含有質(zhì)粒pET-32a(+)-SPAG11D陽性克隆菌分別在37 ℃條件下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，用15% SDS-PAGE對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析。誘導(dǎo)后在33kDa左右處有一明顯蛋白帶，與預(yù)期的大小相符，而未誘導(dǎo)菌沒有同樣大小的特征帶，說明目的基因成功表達(dá)(圖4、圖5)。誘導(dǎo)最佳時(shí)間為4 h，誘導(dǎo)最佳IPTG濃度為1.0 mmol/L。 　　2.5 重組蛋白抑菌活性測定

　　檢測了表達(dá)的重組蛋白在體外對(duì)霍亂弧菌O139、大腸桿菌K199、K88、O157、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌性。結(jié)果顯示，重組蛋白對(duì)霍亂弧菌的生長有抑制作用(圖6)。

　　3 討論

　　睪丸、附睪和精囊等生殖道的感染嚴(yán)重威脅雄性的生殖和內(nèi)分泌功能[2]。泌尿生殖道微生物大多數(shù)為表皮葡萄球菌和棒狀桿菌，少數(shù)為革蘭陰性桿菌、大腸桿菌、支原體、衣原體等[11]。其中大腸桿菌可引起40%～70%的精子活動(dòng)凝聚，使精子活力下降，從而影響生育[12]。防御素是存在于哺乳類動(dòng)物體中的抗微生物肽，在天然免疫過程中起到重要的作用，而且對(duì)機(jī)體無毒副作用。SPAG11蛋白是β防御素的一種，對(duì)人、猴的研究表明一些SPAG11蛋白亞型對(duì)大腸桿菌、奈瑟菌、腸球菌和葡球菌具有很好的殺傷能力。本研究表達(dá)的融合蛋白對(duì)霍亂弧菌具有明顯的生長抑制現(xiàn)象，表明牛SPAG11D蛋白具有抗菌活性，與其他物種具有類似的抗菌功能。牛SPAG11D蛋白可能在抵御病原菌侵害雄性生殖道方面發(fā)揮重要的作用。

　　SPAG11在精子成熟過程中可能起到重要的作用，未成熟精子不具有運(yùn)動(dòng)能力，Zhou等[4]發(fā)現(xiàn)大鼠附睪中未成熟精子與附睪上皮細(xì)胞或能表達(dá)SPAG11E(Bin1b)的小腸上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)后具有了運(yùn)動(dòng)能力，而加入SPAG11E抗體后，未成熟精子不具有運(yùn)動(dòng)能力;此外還發(fā)現(xiàn)，精子的運(yùn)動(dòng)能力隨SPAG11E表達(dá)量的降低而下降。牛的SPAG11D存在于發(fā)育后期的精子細(xì)胞中，且在精子細(xì)胞的尾部[8]，與大鼠SPAG11E相類似，可能與精子的運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)。

　　鑒于牛SPAG11D在抵御微生物對(duì)機(jī)體的侵害和生殖功能方面起到重要作用，本研究表達(dá)了牛SPAG11D融合蛋白，且具有很強(qiáng)的抑菌生物活性，而在生殖方面的功能將進(jìn)一步分析研究。

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