摘要：葡萄酒中檸檬酸的檢測方法有很多，其中應用比較多的有：高效液相色譜法、毛細管電泳法、酶法、微電子溶出法、化學法等等。本文主要就褪色分光光度法對葡萄酒中檸檬酸的含量的測定方法進行詳細介紹，以供讀者參考。
　　關鍵詞：葡萄酒；檸檬酸；褪色分光光度法
　　一、褪色分光光度法測定檸檬酸含量的原理
　　褪色分光光度法測定檸檬酸含量的原理是：使用Fe（III）—磺基水楊酸作為指示劑，當Fe（III）—磺基水楊酸處于pH為4.2—4.6的酸性溶液中時會生成紫紅色的絡合物，當向溶液中加入檸檬酸標準液或是含有一定量的檸檬酸溶液時，生成的紫紅色絡合物會褪色至橙黃色。然后在470nm處進行吸光度的測定，吸光度的減小的值與檸檬酸的含量在一定的范圍內是成正比的，根據這種方法可以將試樣中的檸檬酸進行定量分析。
　　二、實驗所用的儀器
　　1754型紫外可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司
　　2DT-100單盤天平北京光學儀器廠
　　3PHS-3C精密酸度計成都方舟科技開發公司
　　三、儀器條件的選擇
　　本次實驗的儀器選擇方面主要在于對分光光度計和PHS-3C精密酸度計的選擇上，由于實驗的方法需要進行吸光度的測定，因此需要使用靈敏性高的紫外可見分光光度計進行測定。PHS-3C精密酸度計可以準確的將溶液的pH測定出來，本實驗需要將反應的pH進行精確測定，因此需要使用。DT-100單盤天平的使用主要是在試劑的配置時需要。
　　四、實驗所需試劑
　　所用試劑均為分析純，所用水均為去離子水。
　　1Fe3+溶液(1.000×10-2mol•L-1)：稱4.8220gNH4Fe(SO4)2•12H2O，用0.025mol•L-1HCLO4溶解，加水定容至1000mL。
　　2磺基水楊酸溶液(1.000×10-2mol•L-1)：稱磺基水楊酸2.5420g，用0.025mol•L-1HCLO4溶解，加水定容至1000mL。
　　3HAc-NH4Ac溶液：取冰HAc28mL，加500mL水稀釋，然后用濃氨水調溶液pH至4.5為止。HCLO4溶液(1.0×10-2mol•L-1)。
　　4葡萄酒試樣：取1mL葡萄酒液定容于100mL的容量瓶中進行稀釋100倍。
　　五、褪色分光光度法的測定方法
　　1在25mL的比色管中分別加入剛配置好的新鮮的Fe（III）溶液1.0mL、磺基水楊酸溶液4.0mL和HAc-NH4Ac緩沖液4.0mL，水定容至刻度，邊定容邊輕輕搖勻。
　　2放置10min后，使用1.0cm的比色皿，以蒸餾水作為對照，在470nm處進行吸光度的測定，得到磺基水楊酸鐵絡合物的吸光度A1。
　　3取另一只25mL的比色管，與上述操作相同，不過注意在定容前先加入0.5mL稀釋了的葡萄酒試樣，然后進行470nm處的吸光值的測定，測得的吸光值為A2，即為褪了色的磺基水楊酸鐵絡合物。
　　4進行計算，根據ΔA=A1-A2進行計算。
　　5檸檬酸標準曲線的繪制。按上面的方法，僅在加入試樣時改為加入檸檬酸標準液，依次為0.0mL,0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL。分別測其吸光值，并求出與之相對應的褪色吸光值差ΔA的值，然后輸入Excel中進行檸檬酸溶液標準曲線的繪制，并求出相應的回歸方程，得到的方程為：
　　ΔA=0.6294a+0.0396，其中a是檸檬酸的含量，單位為mg/25mL。其適用范圍為0—40μg/mL。相關系數是0.9923，大于所要求的臨界值標準0.917，說明了此回歸方程有效。回歸方程制作成表格，如下表：
　　
　　6然后根據上一步得到的葡萄酒試樣的ΔA值進行代入回歸方程：ΔA=0.6294a+0.0396中，求出a，即為葡萄酒試樣中的檸檬酸含量。
　　六、實驗過程中應考慮的問題
　　1測定波長的選擇
　　為了選擇最佳的測定波長，試驗在前期做了一系列的預實驗，其中很重要的一個方面是測定波長的選擇。由于紫外可見光分光光度計十分靈敏，測定波長稍一改變就會對整個實驗的結果產生巨大的影響，因此在進行實驗前一定要確定最佳的測定波長，即所謂的最大吸收波長。
　　預實驗的方法是：與上面的實驗原理和方法大致相同，只是在進行紫外可見光分光光度計進行測定時，測定波長分別選擇：440nm，450nm，460nm，470nm，480nm，490nm，500nm，510nm。在這幾個波長下進行磺基水楊酸鐵的絡合物以及顯色劑的吸收關譜，得到的結果如下表。
　　
　　表中可以看出，當測定波長為470nm時，所得的絡合物、顯色劑以及ΔA的吸光值都是最大的，因此本實驗就采用470nm作為檸檬酸含量測定的測定波長。
　　2顯色的pH的范圍
　　顯色的pH的選擇也很關鍵，因為所選的指示劑Fe（III）—磺基水楊酸只有在一定范圍的酸性溶液中才能生成相應的絡合物才能進行一下步驟的操作，因此實驗前確定實驗溶液所需的pH值的范圍很有必要。
　　pH值的范圍確定也是通過一系列的實驗進行確定的。實驗方法同上，只是將溶液的pH進行改變，分別取pH為：3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8，然后進行實驗，結果顯示：當pH在4.2—4.6時，所得的絡合物顏色鮮艷，而且所測得的ΔA值較大并且穩定，因此，在測定時應選擇的pH值范圍是：4.2—4.6。其中，當pH值為4.5時，所測的ΔA值最大且最穩定，因此本實驗選擇pH為4.5來進行測定。
　　3試劑的用量
　　3.1磺基水楊酸和Fe離子的用量選擇
　　磺基水楊酸和Fe離子作為整個實驗的指示劑，其用量多少的選擇是非常關鍵的，因此也需要通過預實驗進行確定。方法依舊同上，只是將磺基水楊酸的用量進行改變，磺基水楊酸的量分別選取：3.0mL，3.5mL，4.0mL，4.5mL，5.0mL。實驗結果顯示，當選取磺基水楊酸的量為4.0mL時，實驗所得的ΔA值最大而且最為穩定，因此本次實驗所選取的磺基水楊酸的量即為4.0mL。磺基水楊酸的量一旦確定，根據絡合物的化學反應可知所需的鐵離子的量也是4.0mL。
　　3.2緩沖劑的用量的選擇
　　緩沖溶液也是實驗成敗、結果準確與否的一個重要因素，緩沖溶液加的太多會稀釋指示劑和試樣的量，造成結果過小或是檸檬酸含量過低而不能夠被檢測到，ΔA值很小；但是緩沖液加的太少會使整個系統的pH值變化劇烈，使得絡合物的性質等都不穩定，測得的結果自然更加不準確。

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