[摘要]研究地道藥材禹州漏蘆主要活性成分總黃酮(FELT)對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠Wnt信號(hào)的影響。采用大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分法和MTT檢測(cè)FELT對(duì)AA大鼠的治療作用，Real-time qPCR檢測(cè)FELT灌胃治療對(duì)AA大鼠滑膜中Wnt信號(hào)關(guān)鍵基因β-catenin，C-myc和cyclin D1表達(dá)的影響，Real-time qPCR檢測(cè)FELT灌胃治療對(duì)AA大鼠滑膜中Wnt信號(hào)上游負(fù)調(diào)控基因SFRP 1，2，4，5表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FELT對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分和MTT值有顯著的抑制作用，對(duì)Wnt信號(hào)關(guān)鍵基因β-catenin，C-myc和cyclin D1表達(dá)有顯著的抑制作用，對(duì)SFRP 1，2，4表達(dá)有顯著的上調(diào)作用。FELT灌胃治療對(duì)AA大鼠有較好的治療作用，這種治療作用可能是通過(guò)對(duì)Wnt信號(hào)的抑制實(shí)現(xiàn)的。

　　[關(guān)鍵詞]省級(jí)期刊論文發(fā)表,禹州漏蘆總黃酮,佐劑性關(guān)節(jié)炎,Wnt,β-catenin

　　Flavonoids of Echinps latifolius suppress Wnt signaling in adjuvant arthritis rats

　　MIAO Cheng-gui1，2，3*， XU Jian1， GAO Hu1， LIU Liang-liang1， ZHOU Guo-liang1， QIN Mei-song1， CHEN Jian-zhong1， LI Cheng-feng1

　　(1. Food and Drug College， Anhui Science and Technology University， Bengbu 233100， China;

　　2.College of Pharmacy， Anhui Medical University， Heifei 230032， China;

　　3. Poultry Disease Monitoring Anhui Key Laboratory， Anhui Science and Technology University， Bengbu 233100， China)

　　[Abstract]The role of flavonoids of Echinps latifolius(FELT) in Wnt signaling was investigated in adjuvant arthritis (AA) rats. The therapeutic effects of FELT on AA rats were detected by rat arthritis score and MTT. The effect of FELT gavage treatment on the Wnt signaling key gene β-catenin， C-myc and cyclin D1 in synovium from AA rats was detected by Real-time qPCR， and the effects of FELT gavage treatment on the upstream negative regulation gene SFRP 1，2，4，5 in synovium from AA rats were detected by Real-time qPCR. The results showed that FELT gavage treatment significantly inhibited arthritis score and MTT values in AA rats， significantly inhibited the expression of the Wnt signaling gene β-catenin， C-myc and cyclin D1， significantly up-regulated the expression of the upstream negative regulation gene SFRP 1，2，4. FELT has a better therapeutic effect for AA rats.

　　[Key words]flavonoids of Echinps latifolius; adjuvant arthritis; Wnt; β-catenin

　　doi：10.4268/cjcmm20150125

　　類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種慢性、系統(tǒng)性、多關(guān)節(jié)性疾病，發(fā)病機(jī)制仍不清楚，世界范圍內(nèi)RA發(fā)病率為0.5%～1.0%，部分地區(qū)高達(dá)5%[1-2]。成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)在RA發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[3-4]。Wnt信號(hào)參與了RA的發(fā)病機(jī)制，與FLS異常活化增殖、持續(xù)的滑膜炎癥、軟骨侵蝕、骨的破壞等有關(guān)，Wnt通路相關(guān)分子可能是潛在的RA治療靶點(diǎn)[5]。禹州漏蘆為菊科華東藍(lán)刺頭Echinps latifolius Tausch的干燥根，主產(chǎn)于安徽、湖北、河南等省，其中以安徽、湖北的產(chǎn)量最大、質(zhì)量最好。禹州漏蘆具有抗炎、鎮(zhèn)痛、耐缺氧、抗疲勞、降血壓及降血脂等藥理作用，是一種極具研究開(kāi)發(fā)價(jià)值的中草藥[6]。本文采用滁州產(chǎn)禹州漏蘆為研究對(duì)照，分離提取其總黃酮，采用佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠為AA，大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分法和MTT檢測(cè)禹州漏蘆總黃酮(FELT)對(duì)AA大鼠的治療作用，Real-time qPCR檢測(cè)FELT灌胃治療對(duì)AA大鼠Wnt信號(hào)和對(duì)Wnt信號(hào)上游負(fù)調(diào)控基因SFRP 1，2，4，5表達(dá)的影響，為禹州漏蘆的綜合開(kāi)發(fā)積累實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為RA治療提供新思路。 　　1材料

　　1.1儀器Applied Biosystems Gene Amp StepOneTM Real-time qPCR System(美國(guó)ABI公司);CO2培養(yǎng)箱(Thermo);超凈工作臺(tái)(江蘇凈化儀器設(shè)備有限公司);倒置熒光顯微鏡、倒置顯微鏡(奧林巴斯);ChemiScope3400 Mini化學(xué)發(fā)光成像(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司);FA/JA型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);101AS-3型數(shù)顯恒溫干燥箱(上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠)。

　　1.2藥品與試劑禹州漏蘆采集于安徽省滁州市鳳陽(yáng)縣鳳陽(yáng)山地區(qū)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)王德群教授鑒定為菊科植物藍(lán)刺頭E. latifolius干燥根，正品。禹州漏蘆總黃酮(FELT)由安徽科技學(xué)院藥學(xué)系藥物化學(xué)室研制。取安徽滁州產(chǎn)禹州漏蘆干燥根，乙醇提取后減壓濃縮，水溶液調(diào)pH至2.0，乙醚萃取后有機(jī)相精制濃縮，水相大孔樹(shù)脂吸附，二者混合后濃縮為浸膏得FELT，以蘆丁為對(duì)照品，HPLC檢測(cè)FELT純度為82.56%;QuantiFast SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas);β-catenin，C-myc，cyclin D1等定量PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

　　2方法

　　2.1AA大鼠制備SD雄性大鼠，體重180～200 g，安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：皖醫(yī)動(dòng)準(zhǔn)01號(hào))，隨機(jī)分為6組：正常組、AA組、FELT低、中、高劑量組(50，100，150 mg・kg-1)、布洛芬陽(yáng)性對(duì)照組(8 mg・kg-1)，每組10只[7-8]。AA組及各給藥組以福氏完全佐劑于每只大鼠右后足跖皮內(nèi)注射0.1 mL致炎，正常對(duì)照組注射0.1 mL PBS。

　　2.2AA大鼠關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)炎評(píng)分是基于對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠不同部位的癥狀進(jìn)行量化評(píng)價(jià)，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下。耳朵：0分，無(wú)結(jié)節(jié)和紅腫;1分，1只耳朵出現(xiàn)結(jié)節(jié)和紅腫;2分，2只耳朵都出現(xiàn)結(jié)節(jié)和紅腫。鼻子：0分，無(wú)結(jié)節(jié)和紅腫;1分，鼻子上出現(xiàn)結(jié)節(jié)和紅腫。尾巴：0分，無(wú)結(jié)節(jié)和紅腫;1分，尾巴出現(xiàn)結(jié)節(jié)和紅腫。足爪：0分，足爪無(wú)結(jié)節(jié)和紅腫;1分，1只足爪出現(xiàn)結(jié)節(jié)和紅腫;2分，2只足爪出現(xiàn)結(jié)節(jié)和紅腫;3分，3只足爪出現(xiàn)結(jié)節(jié)和紅腫;4分，4只足爪出現(xiàn)結(jié)節(jié)和紅腫。上述評(píng)分的加和即為每只佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠評(píng)分，最高評(píng)分為8分。

　　2.3大鼠滑膜FLS原代培養(yǎng)引頸處死大鼠，無(wú)菌條件下取滑膜組織，D-Hanks液反復(fù)漂洗組織塊3次后剪成約1～2 mm3小塊。37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，使其貼壁。取出培養(yǎng)瓶加入預(yù)溫的20%小牛血清DMEM培養(yǎng)液3 mL，再置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待滑膜FLS長(zhǎng)出組織塊較多后，棄除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋瓶底90%，0.5 g・L-1胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為傳代3～5次細(xì)胞。

　　2.4MTT檢測(cè)FLS增殖活性用含15%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液混懸FLS，制備FLS懸液，濃度為1×105個(gè)/mL。將FLS懸液加至96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于37 ℃，5%CO2條件培養(yǎng)24 h。FLS貼壁后換新的培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后。每孔加MTT液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，加入100 μL DMSO，酶標(biāo)儀檢測(cè)，結(jié)果以3個(gè)復(fù)孔的均值表示。

　　2.5Real-time qPCR檢測(cè)FELT對(duì)AA大鼠滑膜β-catenin，C-myc和cyclin D1表達(dá)的影響分離對(duì)照大鼠和AA大鼠滑膜組織，采用Real-time qPCR檢測(cè)FELT對(duì)AA大鼠滑膜Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵基因β-catenin，C-myc和cyclin D1表達(dá)的影響。引物序列見(jiàn)表1。

　　2.6Real-time qPCR檢測(cè)FELT對(duì)AA大鼠滑膜SFRP 1，2，4，5表達(dá)的影響分離對(duì)照大鼠和AA大鼠滑膜組織，采用Real-time qPCR檢測(cè)FELT對(duì)AA大鼠滑膜中Wnt信號(hào)上游負(fù)調(diào)控基因SFRP 1，2，4，5表達(dá)的影響。引物序列見(jiàn)表1。

　　2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以±s表示，組間比較采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　3結(jié)果與分析

　　3.1對(duì)AA大鼠的治療作用AA大鼠在造模后第12天繼發(fā)性炎癥明顯，四肢出現(xiàn)紅腫，關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯著增高。相較于AA組大鼠，F(xiàn)ELT各治療組大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯著降低，見(jiàn)圖1。

　　3.2對(duì)AA大鼠FLS異常增殖的抑制作用與AA組大鼠相比，F(xiàn)ELT各治療組大鼠MTT值顯著降低，見(jiàn)圖2，提示FELT對(duì)AA大鼠FLS異常增殖有抑制作用。

　　3.3Real-time qPCR檢測(cè)FELT對(duì)AA大鼠滑膜β-catenin，C-myc和cyclin D1表達(dá)的影響與AA組大鼠相比，F(xiàn)ELT治療組大鼠滑膜中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵基因β-catenin，C-myc和cyclin D1表達(dá)均顯著降低，見(jiàn)圖3，表明FELT具有抑制AA大鼠滑膜β-catenin，C-myc和cyclin D1表達(dá)和抑制Wnt信號(hào)的作用。

　　3.4Real-time qPCR檢測(cè)FELT對(duì)AA大鼠滑膜SFRP 1，2，4，5表達(dá)的影響與AA組大鼠相比，F(xiàn)ELT治療組大鼠滑膜中Wnt信號(hào)通路上游負(fù)調(diào)控基因SFRP 1，2，4表達(dá)均顯著升高，見(jiàn)圖4，表明FELT可能通過(guò)對(duì)Wnt上游負(fù)調(diào)控基因SFRP 1，2，4表達(dá)的上調(diào)抑制AA大鼠Wnt信號(hào)激活。 　　4討論

　　按照信號(hào)通路的激活是否依靠β-catenin的活化，Wnt通路分為經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路。大多數(shù)Wnt信號(hào)的研究都著眼于β-catenin介導(dǎo)的Wnt經(jīng)典信號(hào)通路[9]。例如，在結(jié)腸癌中，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中的β-catenin上調(diào)myc，cyclin D1基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖癌變[10]。在非洲蟾蜍中，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中的β-catenin上調(diào)纖維連接蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的黏附和活化[11]。有證據(jù)表明ERK家族激酶能夠被β-catenin經(jīng)典信號(hào)激活，參與數(shù)種細(xì)胞分化過(guò)程。Wnt非經(jīng)典信號(hào)通路包括Wnt/Ca2+信號(hào)通路和細(xì)胞極性通路。研究表明Wnt4和Wnt5a激活Wnt/Ca2+信號(hào)通路，此激活過(guò)程通過(guò)特定的G蛋白激活磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)，PI-PLC水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)生成二脂酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)。細(xì)胞膜上的DAG在Ca2+和磷脂酰絲氨酸協(xié)助下激活蛋白激酶C(PKC)，PKC作用于細(xì)胞膜受體等相應(yīng)靶蛋白，使之磷酸化影響信號(hào)傳導(dǎo)。細(xì)胞極性通路前半部分與Wnt 經(jīng)典通路完全相同， 不同之處在于Dvl由保守區(qū)域DIX，PDZ和DEP組成，DIX和PDZ介導(dǎo)經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路，DEP介導(dǎo)細(xì)胞極性通路的激活，例如Wnt7a與Fz受體結(jié)合激活細(xì)胞極性通路[12]。

　　Wnt信號(hào)調(diào)控細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞癌變、腫瘤侵襲生長(zhǎng)等，與腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，Wnt信號(hào)在調(diào)控RA發(fā)生發(fā)展過(guò)程中同樣起重要作用[13-14]。與正常人滑膜組織相比，Wnt1，Wnt5a，Wnt5b，Wnt7b和Fz5在RA病人滑膜中顯著高表達(dá)，Wnt1，Wnt5a和Fz5的高表達(dá)與RA炎癥程度有關(guān)[15]。在RA病人關(guān)節(jié)FLS中同樣檢測(cè)到Wnt1，Wnt5a和Fz5高表達(dá)，進(jìn)一步印證Wnt1，Wnt5a和Fz5與RA的密切相關(guān)[16]。SFRP作為Wnt的負(fù)調(diào)控蛋白分子在RA滑膜組織和FLS中都有表達(dá)，即RA特異的疾病內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)了SFRPs的差異表達(dá)。SFRPs與炎癥因子表達(dá)及RA發(fā)病機(jī)制可能有關(guān)[17]。

　　本文研究了FELT對(duì)AA大鼠的治療作用及其信號(hào)通路，為滁州產(chǎn)禹州漏蘆的綜合利用開(kāi)發(fā)積累實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為RA防治提供新的思路。

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